Логотип ZooAtlas.ru Атлас собак ZooAtlas.ru Атлас кошек ZooAtlas.ru Атлас обитателей аквариума ZooAtlas.ru Атлас птиц ZooAtlas.ru Атлас экзотических животных ZooAtlas.ru
питомники собак, питомники кошек






ПЦР-диагностика вирусных и бактериальных инфекций домашних животных

ПЦР-диагностика вирусных и бактериальных инфекций домашних животных



01.09.2008

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной диагностики, ставший для многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы. Специфичность ПЦР для вирусных, хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР-анализ состоит из нескольких этапов. Первый этап — пробоподготовка — заключается в обработке исследуемого материала (приготовление суспензии, центрифугирование). На втором этапе проводится выделение наследственного материала — ДНК или РНК — из клеток. При этом после лизиса клеток и разрушения комплекса «ДНК-белок» производится осаждение ДНК или РНК на сорбенте с последующим переходом их в элюирующий буфер. На третьем этапе проводится амплификация, то есть умножение количества специфических участков ДНК. Для этого используются тест-системы, в состав которых входят праймеры — олигонуклеотиды, которые являются специфическими для каждого возбудителя. К разлитой в микропробирки ПЦР-смеси добавляют образцы и контроли, которые помещают в амплификатор или термоциклер - программируемый термостат с высокой скоростью и точностью задаваемой температуры. Процесс амплификации заключает в себе три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. При определении в клинических образцах РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции, при которой РНК переводят в форму ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Четвертый этап ПЦР-диагностики заключается в проведении электрофоретической детекции продуктов ПЦР — ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением.

Стадии ПЦР

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки — эппендорфы — объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Забор крови проводят одноразовой иглой в одноразовый шприц или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц, кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Возможно использование вакуумных систем («Vacuette») для забора крови. Для исследования можно предоставить сыворотку крови: пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и переносят в количестве не менее 1 мл в стерильные эппендорфы объемом 1,5 мл.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику.

Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium.

Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%).

Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии.
Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.

Панлейкопения — контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят).

Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек - тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами.

При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.

При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз.

Аденовирус плотоядных. Возбудитель - ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения.

Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.

Токсоплазмоз. Возбудитель - простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты.

Промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. У кошек развитие паразита в кишечнике обычно проходит бессимптомно, изредка вызывая «легкий» понос.

Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит.

Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек — Chlamydophila felts, у собак — Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц - Ch. psittaci.
У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак.

Микоплазмоз. Возбудители — микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.

Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции.
Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.

Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство.

Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата.

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с,
ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН

Журнал "Ветеринарная клиника", июль, 2007

Тоже интересно
Эпилепсия у собак: проблема и решения
Различают «истинную» или первичную эпилепсию и вторичную эпилепсию, причиной возникновения которой служат различные внешние факторы.
Питание стерилизованных котов: советы и рекомендации
Если вы стерилизовали или кастрировали кота или только собираетесь это сделать, то вам необходимо знать: ваш питомец теперь будет вести образ жизни, отличный от дооперационного. И если вы хотите, чтобы он был здоров, необходимо знать, каким отныне должен быть его рацион.
Умный, еще умнее, или о пользе Омега-3
Бытуют мнения, и некоторые подтверждены учеными, что существует так называемая лига самых умных пород собак, «золотая десятка».
Автомобильные травмы: что делать, если собака попала под машину
Большинство собак не испытывает страха перед машинами. Собаки не способны оценить скорость приближения транспорта. Ни диплом по дрессировке, ни инертный характер не дают гарантий, что собака не выскочит на дорогу.
Что нужно знать будущему владельцу хорька
Хорек – это зверек с уникальным нравом и необычным поведением. Причем, поведение самок и самцов отличается. О нравах и повадках этого необычного зверька рассказывает ZooAtlas.ru.
Дизайн: antonsobolev.com

Rambler's Top100

ЗооАтлас — добрые новости, статьи о животных и птицах, атласы пород собак и кошек, виды аквариумных рыбок, грызунов, экзотических домашних зверей.
При полном или частичном использовании материалов активная индексируемая ссылка на ZooAtlas.ru обязательна.
© 2008—2017 ZooAtlas.ru
Написать редактору ZooAtlas.ru